NOVÝ DÍLČÍ REVOLUČNÍ POSTUP VE ŠLECHTĚNÍ SKOTU MÁ KOSTRBATÉ JMÉNO - CRISPR-Cas9

Z vývoje plemenitby a šlechtění hospodářských zvířat za poslední léta je zřejmé, že klasickému šlechtění, jak jsme ho znali, zazvonila na začátku 21. století hrana. Tedy v nejvyspělejších zemích. Tradiční selekce (těch nejlepších z nejlepších a jejich další rozmnožování) se ukázala jako velmi pomalá a neefektivní, v porovnání s do praxe zaváděnými postupy molekulární genetiky. Genomiku, genomickou selekci, genomické testanty, v kombinaci s biotechnologiemi jako ovum-pick up, in vitro oplození a embryotransfer, už vyspělé země považují za rutinní techniky. Do rutinní praxe se brzy dostane genomická biopsie, jako součást IVF, a zákonitě se nabízí otázka, co přijde jako nejbližší další krok. Současný trend poukazuje na CRISPR-Cas9. Nepříliš sympaticky vyhlížející složenina zkratek skrývá velké možnosti – sice editovat genetickou informaci, cíleně, svědomitě, bez přešlapů a odpovědně.

Není bez zajímavosti, že na počátku objevu CRISPR-Cas9 byla spíš náhoda a štěstí. A vůbec to nebyli šlechtitelé, kdo tento mechanizmus objevil! Byli to mikrobiologové, studující obranné mechanizmy bakterií. Bylo jim divné, jak se bakterie brání virům – bakteriofágům. Až objevili zajímavý molekulární mechanizmus, kterým bakterie ničí genetickou informaci virů. Je až podezřelé, jak moc se tento mechanizmus podobá systému získané imunity vyšších savců, včetně hospodářských zvířat a člověka; bakterie si totiž vytváří směs oligonukleotidů komplementárních ke genetické informaci virů, se kterými se během svého života potkala. Tato směs oligonukleotidů, která nám může připomínat naši směs specifických imunních protilátek, se označuje jako CRISPR. Jakmile bakterii napadne virus, se kterým se bakterie již setkala, bakterie ve své „knihovně“ zvané CRISPR najde příslušný oligonukleotid a pomocí Cas9 rozstříhá virovou ribonukleovou kyselinu na neškodnou padrť. Jak lze ale tohoto důmyslného systému využít ve šlechtění zvířat?

V laboratorních podmínkách si lze „knihovnu“ CRISPR vytvořit uměle a zcela cíleně. Pak už stačí „spustit“ molekulární tandem CRISPR-Cas9, kdy enzym Cas9 podle námi vytvořeného oligonukleotidu najde a vystřihne úsek DNA, který chceme upravit. A taková úprava může znamenat nahrazení genu alelou, která je pro nás výhodná. Samozřejmě že využití CRISPR-Cas9 ve šlechtění znamená rozsáhlou optimalizaci a zavádění dílčích postupů, protože samotný systém tak, jak ho „vymyslely“ bakterie, by nám nestačil. Ve šlechtění skotu bude klíčové sestrojit správný oligonukleotid, kterým vyhledáme příslušné místo v genomu, které chceme editovat. S tím souvisí dokonalá znalost genomu skotu, zejména genů, které chceme editovat. Když už najdeme gen, který chceme upravit, musíme vědět, co je naším cílem – tedy jak má vypadat gen, kterým budeme stávající genom upravovat. To samo o sobě vyžaduje velmi dobrou znalost genotypu s jeho fenotypovým projevem, tzn. znát přesnou sekvenci nukleotidů v genu, který je odpovědný např. za bezrohost. A to již známe...

Celé to zní jako smyšlená sci-fi pohádka o šlechtění daleké budoucnosti. Že se nejedná o utopickou představu, dokládá nedávný počin americké biotechnologické firmy Recombinetics Inc., jehož výsledkem je právě bezrohý holštýn. Biotechnologové zRecombinetics totiž měli důležité předpoklady: umí velmi dobře základní biotechnologické postupy, jako je in vitro oplození a produkce embryí; to je nezbytné, protože k editaci se používá jedna jediná buňka – sice ta, která dává vzniknout novému jedinci, tedy zygota. Právě do zygoty se injikuje sekvence nukleotidů, odpovědná za bezrohost, kterou v Recombinetics dobře znají a dokáží si jí připravit. Současně měli v Recombinetics už zvádnutou i metodu CRISPR-Cas9, takže dokázali v zygotě najít gen kódující rohatost a nahradit ho alelou, která je spojená s bezrohostí.

Bezrohost se v Recombinetics ukázala jako velmi šikovná volba; jednak proto, že je determinována přítomností min. jedné dominantní alely a i heterezygoti jsou bezrozí. Dalším důvodem byl jistě dalekosáhlý technologický a ekonomický důsledek bezrohosti. Bezrohost navíc vždycky představovala pro šlechtitele velkou výzvu – na bezrohost se snažil šlechtit nejeden farmář, ale většina z nich na to doplatila oproti standardní populaci nižším genetickým potenciálem vyšlechtěných jedinců. I v současné době jsou chovatelé bezrohého holštýnského skotu se svými stády v průměru na nižší úrovni než chovatelé, kteří neselektují na bezrohost. Ti nejlepší ale přesto komerčně profitují, protože o bezrohost je potenciální zájem. Důvodem je při konzervativních postupech minulého století nešťastná genová vazba genu mezi bezrohostí (přesněji řečeno rohatostí) a kvantitativními znaky,

především užitkovosti. K „bezrohosti“ si můžeme pomoct jinými prostředky (odrohování), než abychom museli vědomě snižovat kvalitu býků, které používáme.

Výsledek úsilí vynaloženého v Recombinetics představuje skvělý způsob, jak i vysoce užitkové potomstvo zbavit rohů. Stačí aktuální populaci nejlepších otců býků produkovat in vitro oplozením (což se již beztak děje) a jednobuněčné zygoty editovat tak, že jim „vystřihneme“ gen pro rohatost a nahradíme ho alelou, která determinuje bezrohost. Zní to příliš jednoduše a patrně bychom se podivili, kdy by tu neexistovalo nějaké „ale“...

Tím avizovaným „ale“ je v tomto případě legislativa. Editace genomu totiž řadí bezrohé Holštýny do kategorie GMO - geneticky modifikovaných organizmů. Tato kletba je méně anebo více slučitelná s komerčním využitím. V USA v současné době v USA již probíhá řízení, které by mělo rozhodnout o tom, zda je bezrohý holštýn, připravený metodou CRISPR-Cas9, GMO či nikoliv. Argument, který Recombinetics používá v obhajobě metody CRISPR-Cas9, je skutečnost, že vložený gen není pro holštýnskou populaci cizorodý – ale je to alela, která se v populaci přirozeně vyskytuje a je jí vlastní. Americká Food and Drug Administration zatím považuje za cizorodý samotný postup CRISPR-Cas9. To se ale může v dohledné době změnit a s velkou pravděpodobností změní.

Je zřejmé, že důsledek rozhodnutí americké administrativy bude dalekosáhlý a prakticky rozhodne o možnosti použít této metody pro tvorbu kompletně bezrohé populace holštýnů, v relativně velmi krátké době několika málo let. A pokud bude tento nově bezrohý holštýn shledán jako z pohledu ochrany lidské populace „neškodný“, patrně se bude jednat o precedens pro další úpravy genomu. Stejně jako k bezrohosti se totiž lze tímto postupem dostat k výhodným a žádoucím alelám beta- a kappa-kaseinu, A2A2 mléka (antialergické), k eliminaci recesivních genetických vad či ke změně celé populace na jen černou či červenou a dalších kvalitativních vlastností.

Nadcházející čas ukáže, zda lze s CRISPR-Cas9 počítat jako s další rutinně použitelnou metodou v moderního šlechtění skotu.

 

Null Autor: Ing. Jan Nevoral, Ph.D.